如何利用高速冷凍離心機去培養(yǎng)管分離細(xì)胞膜

50 ml 離心管在離心時的最高轉(zhuǎn)速都低于12000rpm，赫西儀器出產(chǎn)的3H系列高速冷凍離心機特別配置了新型的專用于組織培養(yǎng)管的高速轉(zhuǎn)頭，并專門定制了高強度的50ml 錐底管。用這種轉(zhuǎn)頭分離細(xì)胞器，離心時間短，分離效果好。

設(shè)備：赫西3H系列冷凍高速離心機，6×50ml高速轉(zhuǎn)頭， 50 ml 離心管。

臺式高速冷凍離心機3H20RI

操作步驟：

1．成年鼠肝勻漿2000xg（約4000rpm） 離心15分，4℃（6×50ml高速轉(zhuǎn)頭）

2．沉淀用1mM NaHCO3 稀釋再在4000rpm離心15分，4℃

3．沉淀按濕重1g/ml NaHCO3 稀釋后配成68％蔗糖液，置于離心管下部，上部用42％蔗糖液

4．6×50ml高速轉(zhuǎn)頭，42200xg（18000rpm），4℃離心90分鐘，加速“5”減速“5”

5．離心后，粗制細(xì)胞膜在42％與68％蔗糖液之間形成

6．粗制細(xì)胞膜吸出后，用1mM NaHCO3 稀釋后，再以2000xg（約4000rpm）4℃離心30分，重復(fù)二次

7．去除上清液沉淀，再用1mM NaHCO3 稀釋，在50ml 離心管中，從底部依次向上鋪設(shè)：68％蔗糖液（稀釋樣品配成）、48％蔗糖液、42％蔗糖液。

8．鋪好后再次離心，6×50ml高速轉(zhuǎn)頭，18000rpm，4℃，90分鐘，加速“5”減速“5”

9．離心結(jié)束后可以看出細(xì)胞膜分布在42％與48％蔗糖液之間

成果：階梯形蔗糖梯度在50ml 離心管中用高速冷凍離心機分離亞細(xì)胞構(gòu)造（膜、線粒體、溶酶體、高爾基復(fù)合體、微體等），由于開發(fā)了高強度的組培養(yǎng)管而變得更為可行。

通過上例，我們可以選擇不同的蔗糖階梯度來分離細(xì)胞器，可以得到相當(dāng)高的純度。除了蔗糖梯度以外，用Percoll及Nycodenz 的自形成、予形成或階梯梯度分離亞細(xì)胞構(gòu)造，近年來被廣泛應(yīng)用。