細胞器的分離和鑒定

        許多具有生物活性的生物大分子和亞細胞器很不穩(wěn)定，在分離過程中要求溫度低，操作溫和，不能應(yīng)用一般的化學(xué)分離方法，因此需用到赫西儀器生產(chǎn)的3H20RI高速冷凍離心機。如常用差速離心法分離亞細胞器、線粒體、微粒體和細胞核等，在分離亞細胞的過程中要注意盡可能地保存其原來活性和結(jié)構(gòu)形態(tài)。

試劑：

1、0.25mol/L蔗糖液100ml，pH7.5

稱取蔗糖8.6g溶于少量重蒸餾水，用1mol/LNaOH調(diào)整pH7.5，1mol/LNaOH的用量約0.75ml，再加蒸餾水至100ml即可。4℃可保存一周。

2、MA液：4℃保存1~2周。

0.25mol/L蔗糖液8.6g/100ml

10mmol/L Tris-HCL液0.12g Tris/100ml用HCL調(diào)pH8.0(約1mol/L HCL0.215ml)

3mMMgCl₂0.061g/100ml

先配制Tris-HCL液，用該溶液溶解蔗糖和MgCl₂至100ml

3、MB液：4℃保存1~2周

配制同MA液，在MA溶液中加0.1ml Triton X-100/100ml

4、MC液：4℃保存1~2周

2.2mol/L蔗糖75.3g/100ml

5、0.4mol/L KCl溶液：2.98g/100ml

6、10％過氯酸(PCA)：取99.8％過氯酸100ml加水至100ml

7、二苯胺—冰乙酸溶液：(新鮮配制)

稱二苯胺1.5g溶于100ml冰乙酸中，再加濃硫酸1.5ml

8、1mol/L NaOH

9、0.01％甲烯蘭溶液

操作

(一)細胞器的分離過程

1、肝勻漿制備：將大鼠斷頭放血處死，迅速取出肝臟，用生理鹽水沖凈肝臟表面的血液，剔去結(jié)締組織，稱取1.0克肝組織，剪碎放入盛有0.25mol/L蔗糖液3ml的Tefion-glass勻漿器內(nèi)，接上電動馬達勻漿，直至無肉眼可見的組織殘塊，再把勻漿倒入離心管，用0.25mol/l蔗糖液2ml沖洗勻漿管，一并放入離心管。

2、線粒體和細胞核的分離，按表操作。

(二)細胞器的鑒定：

1、線粒體的鑒定：在線粒體內(nèi)有由氧化還原酶類組成的呼吸鏈，包括NADH氧化呼吸鏈和琥珀酸氧化呼吸鏈。在生理條件下，底物脫下的氫可經(jīng)呼吸鏈徹底氧化生成H₂O，并釋放出能量。

但在體外可用甲烯蘭(MB)作為受氫體。MB按受H₂則變成甲烯白(MBH₂)，顏色由蘭色變白色。

2、細胞核的鑒定：

(1)顯微鏡觀察：用HE染色法，在鏡下觀察核的形態(tài)。

(2)用Burten's法測定DNA濃度：DNA是細胞核內(nèi)的特征性物質(zhì)。各種動物的細胞核所含的DNA量是十分恒定的，不受生理條件、環(huán)境因素等的影響。因此可用測定DNA含量來鑒定細胞核。

取水解上清液1ml放入T管，取10％過氯酸1ml放入B管，分別加二苯胺液4ml于T、B管中搖勻后，置80℃水浴10min，取出冷卻后，在分光光度計上(600nm)測吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用標(biāo)準(zhǔn)管直接計算。

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